INMUNOELECTROFORESIS

La inmunoelectroforesis combina el poder de separación de la electroforesis con la capacidad resolutiva de la inmunoprecipitación, basada en la especificidad inmunológica.

Después de realizar la electroforesis a las muestras de suero, se depositan en pocillos individuales, un suero polivalente (antinmunoglobulinas total) y sueros mono-valentes (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti kappa y anti lambda). El antígeno y el antisuero difunden el uno hacia el otro, y se produce una banda de precipitina cuando alcanzan la zona de equivalencia.

La inmunoelectroforesis tiene su indicación precisa cuando se aprecian anormalidades en el estudio electroforético realizado antes.

El patrón electroforético normal es de fácil interpretación.

Lo mismo ocurre cuando adopta características especiales que identifican a un buen grupo de enfermedades (figuras 2.5 y 2.6).

Un ejemplo de ello se observa cuando en la zona de las alfaglobulinas, de las betaglobulinas o de las gamma-globulinas, zonas que por lo general no tienen picos, aparece un pico proteico, de base estrecha, que señala la presencia de una proteína monoclonal. La inmunoelectroforesis mantiene su vigencia diagnóstica, al igual que la electroforesis y la cuantificación de las inmunoglobulinas, cuando un patrón con estas características está presente.

Las células productoras de inmunoglobulinas (células plasmáticas y linfocitos) tienen una función muy especializada.

Cada una de ellas, agrupadas en clones, produce la misma clase y tipo de inmunoglobulina. La proliferación de estas células, conocidas como inmunocitos, puede ocurrir en varios grupos de ellas, que dan lugar a varias clases y tipos de inmunoglobulinas. En este caso, se dice que la afectación es policlonal (varios clones) y su expresión en el patrón electroforético se caracteriza por un pico proteico no pronunciado, con una base ancha. Si la proliferación ocurre de forma aislada en un grupo celular que produce una clase y tipo de inmunoglobulina, la afectación es monoclonal (un clon) y su expresión en el patrón electroforético se caracteriza por un pico proteico muy pronunciado, con base estrecha, en la zona de las alfaglobulinas, betaglobulinas o gammaglobulinas (figura 2.6, esquemas VII, VIII, IX y X).

La respuesta de los inmunocitos en las enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas es siempre policlonal. En el caso opuesto, cuando la respuesta es monoclonal, en el 45 % de los pacientes constituye un signo de malignidad y se relaciona con enfermedades como mieloma múltiple, amiloidosis, enfermedades linfoproliferativas, plasmocitoma solitario y macroglo-bulinemia.

INMUNOFIJACIÓN ELECTROFORÉTICA

La inmunofijación electroforética ofrece una elevada resolución, por lo que facilita la identificación de proteínas monoclonales en cantidades mínimas. Se basa en la combinación de la electroforesis seguida por la inmunoprecipitación. Las tiras de acetato de celulosa se saturan con antisuero monoespecífico y se aplican a proteínas séricas, antes separadas por electroforesis, en sus respectivas zonas de migración. Durante la incubación, los complejos inmunes formados pueden ser identificados como bandas diferentes. Aunque este método es muy sensible, tiene algunas desventajas, como son: el elevado costo de los antisueros monoespecíficos y la gran cantidad que de ellos se necesita para empapar las tiras de acetato.

TURBIDIMETRÍA

La turbidimetría es uno de los dos métodos que involucra la interacción de la luz con partículas en solución.

Estas disminuyen la trasmisión de la luz debido a la reflexión, dispersión y absorción del rayo luminoso.

Es un método sensible y sigue la ley de Beer en un amplio rango de concentraciones.

NEFELOMETRÍA

La nefelometría es una técnica similar a la turbidimetría y se utiliza cuando las partículas en solución son pequeñas y en escasa concentración. Se emplea con frecuencia para medir la dispersión de la luz, que ocurre como resultado de la reacción antígeno-anticuerpo, lo que permite su cuantificación. Entre sus ventajas se encuentran las siguientes: rapidez, reactivos simples y posibilidades de automatización. Es una metodología simple y precisa. Sus principios se exponen en otra sección de este libro.

INMUNODIFUSIÓN RADIAL

La inmunodifusión radial es un método para cuantificar proteínas mediante una reacción con difusión única en una dimensión.

Los sueros de referencia (calibradores), controladores y muestras, se colocan en pocitos ponchados en gel de agarosa que contiene el antisuero monoespecífico.

El antígeno presente en la muestra difunde de forma radial a través del gel y forma un anillo de precipitación, al unirse al anticuerpo presente en el antisuero monoespecífico (reacción antígeno-anticuerpo).

El diámetro de los anillos se mide, y se calculan los valores. Antes de disponerse de la nefelometría, este método fue muy utilizado para la cuantificación de las inmunoglobulinas.

RADIOINMUNOENSAYO Y ENSAYO INMUNORRADIOMÉTRICO

El principio en que se basan las técnicas de radioin-munoensayo (RIA) y de ensayo inmunorradiométrico (IRMA) es el mismo para ambas. En las dos se utiliza un antígeno marcado con un isótopo (el más frecuente es el 125 I). El antígeno marcado compite por los sitios de unión en el anticuerpo. En este sistema, la avidez del anticuerpo por el antígeno marcado y el no marcado, debería ser igual. Para conocer la cantidad de proteína (antígeno) presente, se obtiene la cuantificación del antígeno marcado, al separar el anticuerpo que está unido al antígeno marcado del antígeno marcado libre.

Esta separación puede lograrse por 3 vías:

1. Absorción del antígeno libre marcado.

2. Precipitación de los antígenos marcado y no marcado unidos al anticuerpo.

3. Uso de anticuerpos de fase sólida para atraer los anticuerpos unidos al antígeno marcado y no marcado.

La inmunorradiometría, a diferencia del RIA, utiliza, en lugar de antígenos, anticuerpos marcados con isótopos. En este tipo de ensayo, el ligando en las muestras compite con el ligando unido a una superficie sólida (tubos o perlas de vidrio recubiertas) por los sitios de unión del anticuerpo marcado. Hay entonces una competencia entre el ligando unido a una superficie sólida y el ligando de la muestra con el anticuerpo marcado. La cantidad de anticuerpo marcado unido a la superficie sólida, es detectada después que el exceso del anticuerpo marcado y la muestra se han eliminado. De nuevo hay una relación

inversa entre la cantidad de radiactividad detectada en el tubo y la concentración del ligando en la muestra desconocida.

ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS

Los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) son métodos muy útiles para la cuantificación de proteínas y se utilizan mucho en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, endocrinas y autoinmunes. Estos requieren de la separación del complejo antígeno-anticuerpo.

Las variantes más comunes son:

1. Método indirecto para la detección de anticuerpos.

2. Método de doble anticuerpo (sándwich) para la detección de antígenos.

Las características del ensayo inmunoenzimático han sido estudiadas en otra sección de este libro. Este método ha desplazado bastante al RIA, al dejar a un

lado las implicaciones que tiene trabajar con material radiactivo. En cuanto a la sensibilidad, el ELISA es similar al RIA, aunque su especificidad es discretamente menor. Los reactivos son estables y las lecturas se pueden realizar en un espectrofotómetro común.

Mención aparte merece la electroquimioluminiscencia, principio que ha invadido el mercado internacional al incorporarse a una gran variedad de equipos automáticos que han simplificado, de forma drástica, los análisis de hormonas, marcadores tumorales, marcadores para anemias, infarto de miocardio y dosificaciones de medicamentos en san-gre.

La electroquimioluminiscencia ocurre con numerosas moléculas como rutenio, osmio y renio. Con el uso del rutenio quelado, como complejo para el desarrollo de luz, se ha hecho posible la determinación de aminoácidos, haptenos y ácidos nucleicos. Este método ha sido descrito en otra sección de este libro (véase el capítulo sobre inmunoquímica).

REACTANTES DE LA FASE AGUDA

Casi todas las proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado, con la excepción de las inmunoglobulinas y las hormonas proteicas. Son múltiples las enfermedades en las cuales se alteran la cantidad y las proporciones de estas proteínas en los líquidos corporales, como ocurre, por ejemplo, en las reacciones inflamatorias que aparecen durante la evolución del infarto del miocardio (IMA), infecciones, tumores, y después de intervenciones quirúrgicas. Las proteínas plasmáticas que sufren alteraciones durante la inflamación, se conocen como reactantes de la fase aguda (RFA). Se supone que este grupo proteico juega un importante papel en el complejo proceso de la inflamación (cuadro 2.1).

Cuadro 2.1 Causas de la elevación de los reactantes de la fase aguda

Enfermedades inflamatorias Enfermedades malignas Traumatismos Posoperatorio Enfermedades autoinmunes

Los niveles plasmáticos de los RFA se elevan en tiempos diferentes. En primer lugar lo hacen la proteína C reactiva (PCR) y la alfa 1 antitripsina; 12 horas después, se elevan la alfa 1 glicoproteína ácida, la haptoglobina, la fracción C4 del complemento y el fibrinógeno. Las últimas en elevarse son la ceruloplasmina y la fracción C3 del complemento. Todas alcanzan su máxima concentración entre 2 y 5 días. Los cambios en su concentración, que responden a un aumento en la síntesis por parte del hígado, no permiten conocer ni la ubicación ni las causas de la reacción inflamatoria, pero constituyen una excelente herramienta para controlar, desde el punto de vista evolutivo, su progreso o desaparición y, por lo tanto, la eficacia o no del tratamiento impuesto (tabla 2.2).

Tabla 2.2 Respuesta de los reactantes de la fase aguda ante el proceso inflamatorio

Reactantes	Elevación de los resultados
	Comienzo(h)	Pico máximo (h)
Proteína C reactiva	2	48
Alfa 1 antitripsina	8	72 - 120
Alfa 1 glucoproteína ácida	8	72 - 120
Haptoglobina	8	72 - 120
C3 y C4	8	72 - 120
Fibrinógeno	8	72 - 120

El aumento de la síntesis de las proteínas de la fase aguda, se acompaña de la disminución de la prealbúmina, de la albúmina y de la transferrina, que constituyen los llamados reactantes de la fase negativa.

Por lo general, las proteínas de la fase aguda forman parte del grupo de las alfa 1 globulinas y alfa 2 globulinas.

Estas, a su vez, constituyen la llamada zona de las alfa en el diagrama electroforético.

El fibrinógeno, proteína de la fase aguda, influye en la determinación de la velocidad de sedimentación eritrocitaria (VSG). En las enfermedades hepáticas crónicas, la concentración del fibrinógeno disminuye, y su efecto acelerador sobre la VSG queda a cargo de la albúmina, que disminuye, y de las globulinas, que aumentan.

LAS ALFAGLOBULINAS Y LAS BETAGLOBULINAS EN LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN ERITROCITARIA

La albúmina es estabilizadora de la VSG. En las infecciones agudas, la albúmina plasmática disminuye y las alfaglobulinas y el fibrinógeno aumentan, combinación que acelera la VSG y que constituye la causa principal de esta aceleración en afecciones como la nefrosis y la cirrosis.

En el mieloma múltiple, la VSG se acelera de manera considerable. La formación de pilas de monedas, originadas por la sedimentación rápida de los eritrocitos, impide muchas veces que se extienda, de forma adecuada, la sangre periférica sobre el portaobjetos. Aunque el cuadro proteico plasmático es muy variable en esta enfermedad, por lo general hay una gran concentración proteica en la zona de las globulinas (pico monoclonal, paraproteína) y una discreta disminución de la albúmina. Estas alteraciones proteicas en el plasma delos pacientes, causan la aceleración de la VSG por encima de 100 mm/h.

En la VSG, la sedimentación de los eritrocitos transita por 3 fases (A, B, C):

A: fase inicial, de pocos minutos, durante la cual se forman las pilas de monedas.

B: fase que tiene una duración de 30 minutos a 2 horas, que depende de la longitud de la pipeta y en el transcurso de la cual la sedimentación ocurre a una velocidad constante.

C: fase lenta, en la que se produce el empaquetamiento de la columna de eritrocitos.

La fase B es la más importante. La VSG debe “montarse” preferiblemente antes de transcurrir 2 horas de tomada la muestra. En determinadas circuns-tancias, este período puede prolongarse hasta 6 horas, pero no más, pues se invalidan sus resultados.

La VSG se determina con métodos manuales y automáticos. Entre los métodos manuales, el más utilizado es el de Westergreen en cualquiera de sus modificaciones.

Para el uso en pediatría, existen las microtécnicas.

CARACTERÍSTICAS DE LAS PROTEÍNAS COMPRENDIDAS EN EL GRUPO DE LOS REACTANTES DE LA FASE AGUDA

Proteína C reactiva (PCR). Esta proteína fue identificada en 1930, en el suero de pacientes con neumonía causada por neumococos y se comprobó que

podía unirse al polisacárido C del Streptococcus pneumoniae, y producir floculación. Luego, se detectó su presencia en otras enfermedades inflamatorias agudas.

La PCR fue el primer reactante de la fase aguda que se identificó. Es sintetizada por el hígado y se vierte en el plasma. Un subgrupo de los linfocitos también la produce en pequeñas cantidades, pero en este caso permanece unida a la superficie celular. Su elevación en el plasma se produce a las 2 horas, y alcanza su máxima concentración a las 48 horas. Esta proteína constituye el marcador de la inflamación por excelencia y tiene numerosas funciones como: dar comienzo a la opsonización, a la fagocitosis y a la activación del complemento, de los neutrófilos y de los monocitos macrófagos. Estas propiedades le permiten jugar un importante papel en el reconocimiento

de organismos microbianos y como inmunomodulador en el huésped. También es importante para el reconocimiento de los tejidos necrosados. Durante muchos años fue poco utilizada, a pesar de conocerse su importancia como marcador inflamatorio. A comienzos de la década de los 90 del siglo XX, se prestó atención una vez más a sus posibilidades de diagnóstico y aparecieron publicaciones más completas, que volvieron a situarla entre las determinaciones más utilizadas en el laboratorio clínico. Un hecho importante en su revalorización, lo fue la comparación de esta prueba con otra, muy utilizada desde hace años como marcador no específico de la actividad de los procesos patológicos: la VSG.

La PCR tiene algunas ventajas en relación con la VSG. Entre ellas sobresale el hecho de que el fibrinógeno, las proteínas monoclonales y la morfología eritrocitaria, no son causas de interferencia. Al igual que la VSG, cuando la PCR es positiva, indica la existencia de un proceso inflamatorio, pero no ofrece datos sobre sus causas.

En relación con los métodos para la determinación de la PCR, también existen ventajas si los comparamos con la VSG.

La VSG, cuando se determina con métodos manuales, requiere de pipetas especiales, de una observación estricta de la relación anticoagulante-sangre, de la colocación de la pipeta cargada en un soporte en posición vertical y del reposo durante 1 hora. Cualquier variación en las condiciones antes señaladas, causa errores groseros en los resultados. Para la VSG existen métodos automáticos que se reservan para los laboratorios que tienen una carga grande de trabajo, que justifique la adquisición de un equipo tan costoso para

realizar ese tipo de análisis.

En su determinación, la PCR ofrece las ventajas siguientes:

1. Prueba de aglutinación con látex, de fácil realización.

2. Ensayos inmunoenzimáticos manuales o automáticos (ELISA), nefelometría con láser, fluorescencia polarizada e inmunoturbidimetría. Ya sea el método manual o el automático, el tiempo consumido en su determinación no es mayor que 10 minutos y el material biológico es, por lo general, suero.

Aunque todavía la VSG se mantiene como una prueba de uso generalizado, tiene en la PCR una potente rival que ha ganado territorios diagnósticos en enfermedades como apendicitis, pancreatitis, enfermedades reumáticas (artritis reumatoidea) y cardiovasculares.

En este grupo de enfermedades y en los trastornos vasculares periféricos, la PCR es considerada un factor de riesgo. A partir de estudios publicados en 1997, se demostró la importancia de la PCR como agente predictivo de futuros IMA, o de la posible repetición del IMA cuando, después de ocurrido el primer ataque, sus valores se mantienen elevados.

Alfa 1 antitripsina. Es un inhibidor de la tripsina y la plasmina, por lo cual protege al cuerpo de la autodigestión. Se eleva en las reacciones de la fase aguda y en el embarazo. Su deficiencia es causa de enfisema pulmonar y falla hepática en la enfermedad homocigótica.

Alfa 1 glucoproteína ácida. Su función es des-conocida.

Su determinación se utiliza para seguir las reacciones de la fase aguda.

Haptoglobina. Se une a la hemoglobina libre en el suero. Se determina para el seguimiento de las reacciones de la fase aguda y en los procesos en los que ocurre hemólisis, como las reacciones postransfusionales y anemias hemolíticas, en las cuales su concentración disminuye al unirse a la hemoglobina libre que proviene de los eritrocitos destruidos.

C3 y C4. Los niveles del complemento aumentan en las reacciones inflamatorias (fase aguda). Sus valores disminuyen en las enfermedades autoinmunes.

Fibrinógeno. Es un factor de la coagulación de la sangre. Además, forma parte de los RFA, por lo que aumenta en las infecciones, en las reacciones inflamatorias y en el embarazo. Disminuye en los trastornos de la coagulación como la coagulación intravascular diseminada (CID), en las enfermedades de origen congénito y adquirido (hepatopatías).